用于亲和层析的洗涤溶液和方法
2019-11-22

用于亲和层析的洗涤溶液和方法

本发明提供用于亲和层析的洗涤方法,其中包含精氨酸或精氨酸衍生物、pH大于8.0的洗涤溶液在没有非缓冲盐的情况下有效移除杂质,而同时增加洗脱物中的产物浓度并维持高百分比产量的回收产物。

感兴趣的蛋白与AC基质的结合通常经柱层析实现。即AC基质在柱内形成,包含感兴趣的蛋白的生化混合物流过所述柱,然后通过洗涤溶液流经该柱来洗涤柱,接着通过洗脱缓冲液流经该柱来从柱中洗脱感兴趣的蛋白。

本文所用的术语“亲和层析基质”或“AC基质”意在指固相介质,通常是凝胶或树月旨,其能在感兴趣的蛋白和AC基质之间高特异性结合相互作用(如受体和配体、酶和底物或抗原和抗体之间)基础上分离生化混合物。因此,所述固相介质包含感兴趣的蛋白能根据缓冲条件可逆粘附的靶标。能组成AC基质的固定或固相介质的非限制性示例包括凝胶基质如琼脂糖珠(例如市售可得的琼脂糖凝胶基质)、和玻璃基质如多孔玻璃珠(例如市售可得的ProSep基质)。

AC基质的其他非限制性示例和其能有效纯化的蛋白类型包括下列:固定化金属离子亲和层析(IMAC)柱(用于纯化有金属离子亲和性的蛋白,如带组氨酸尾的蛋白)、钙调节蛋白树脂柱(用于纯化标记有钙调蛋白结合肽(CBP)的蛋白)、MEPHyperCel™柱(选择性结合免疫球蛋白的纤维素基质)、结合麦芽糖结合蛋白(MBP)的柱(如选择性结合标记有MBP的蛋白的糊精Sepharose™树脂)、结合谷胱甘肽S转移酶(GST)的柱(如选择性结合标记有GST的蛋白的谷胱甘肽Sepharose™树脂)、和结合Strep-标签II的柱(如选择性结合标记有Strep-标签II的蛋白的Strep-Tactin™琼脂糖凝胶树脂)。此外,包含抗体作为附于固相的靶标的免疫亲和基质能用于纯化与附于固相的抗体特异性结合的感兴趣抗原。

尽管本文特别结合使用蛋白A层析的抗体纯化描述了感兴趣的发明,只要本领域已知任何蛋白(包括融合蛋白)选择性结合特定AC基质,所述蛋白能适于用本文所述洗涤方法来纯化。

本发明还通过下列实施例说明,所述实施例不应构成其他限制。所述实施例特别涉及本发明的优选实施方式。本申请中引用的所有参考文献、专利和公开专利申请的内容通过引用明确全文纳入本文。实施例

**,pH用IMTris调整

特定固相基质的性质(尤其是固相附着的靶标的结合性质)决定能用该固相基质纯化的蛋白类型。例如,在本发明的一个优选实施方式中,AC基质是蛋白A柱,其包含一种细菌细胞壁蛋白(即蛋白A)作为固相附着的靶标,所述蛋白A特异性结合某些免疫球蛋白Fc区内的CH2和CH3结构域。本领域已明确蛋白A的结合性质。

实施例2:精氨酸(与高pH组合)是关键赋形剂

需要低pH条件(如pH3-4)以从亲和柱中洗脱结合的目标蛋白,但低pH条件存在可能引起聚集的弊端。历史上,使用不太严格的条件如PH5-5.5以从柱中洗涤非特异性结合的杂质,而同时保留目标蛋白-蛋白A相互作用。然而,由于这些条件下(特别是在高加样密度下运作时)的目标蛋白部分洗脱,回收通常减少。

表2:测试洗涤溶液列表

尽管本文特别结合使用蛋白A层析的抗体纯化描述了感兴趣的发明,只要本领域已知任何蛋白(包括融合蛋白)选择性结合特定AC基质,所述蛋白能适于用本文所述洗涤方法来纯化。

表3:比较低和高pH对ALC表现的影响

AC基质的其他非限制性示例和其能有效纯化的蛋白类型包括下列:固定化金属离子亲和层析(IMAC)柱(用于纯化有金属离子亲和性的蛋白,如带组氨酸尾的蛋白)、钙调节蛋白树脂柱(用于纯化标记有钙调蛋白结合肽(CBP)的蛋白)、MEPHyperCel™柱(选择性结合免疫球蛋白的纤维素基质)、结合麦芽糖结合蛋白(MBP)的柱(如选择性结合标记有MBP的蛋白的糊精Sepharose™树脂)、结合谷胱甘肽S转移酶(GST)的柱(如选择性结合标记有GST的蛋白的谷胱甘肽Sepharose™树脂)、和结合Strep-标签II的柱(如选择性结合标记有Strep-标签II的蛋白的Strep-Tactin™琼脂糖凝胶树脂)。此外,包含抗体作为附于固相的靶标的免疫亲和基质能用于纯化与附于固相的抗体特异性结合的感兴趣抗原。

因此,一方面,本发明提供使用结合感兴趣的蛋白的亲和层析(AC)基质来生成纯化蛋白(如抗体、抗体片段、或包含Fc区的蛋白(如Fc融合蛋白))的方法,所述方法包括在不存在非缓冲盐的情况下,用包含精氨酸或精氨酸衍生物的洗涤溶液在大于8.0的高pH(如优选pH大于8.1,更优选pH大于8.5,例如约8.5-9.5或约8.9-9.0)洗涤AC基质;之后从AC基质洗脱感兴趣的蛋白。AC基质任选地可在加样感兴趣的蛋白和/或洗脱感兴趣的蛋白之前被平衡。